***** 融合相关软组织肉瘤的多组学测序和数据质控分析

服务内容 : 本项目要求对*****融合相关软组织肉瘤样本进行多组学测序，并完成数据质控分析的服务。

项目预算 ：**.*万元

多组学测序详情表：

序号	测序名称	数量
*	单细胞测序**×平台（***-*）	**
*	** 空间转录组	*
*	全基因组外显子	***
*	有参转录组测序	***
*	*** 定量蛋白质组	***
*	*** 磷酸化蛋白质组	***
*	**-**/** 全谱代谢组（****）	***

公司资质类参数指标：

* 、应为法人、其他组织或者自然人，具有独立承担民事责任的能力；法人的分支机构以自己的名义参与本项目采购活动时，应提供依法登记的相关证明文件和由法人出具的对本项目采购活动承担全部直接责任的授权书；自然人应提供身份证明文件；

* 、参加采购活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录；

* 、本次采购不接受联合体响应。

一、单细胞测序**×平台（***-*）具体需求参数

*. 单细胞组学参数指标

（一） 仪器指标：

本项目服务商应具备相关履约能力，包括但不限于：具有性能不低于*** ******** ******** **单细胞标记建库平台；具有性能不低于*******************高通量测序平台，支持*****测序模式，且至少**%的碱基质量分值高于***，并提供证明材料（如：提供设备采购或租赁或合作证明）。

（二） 组织解离及细胞活性要求

*. 细胞活性＞**%；

*. 细胞总量＞******；

*. 结团率＜*%；

*. 细胞浓度范围在***~*********/μ* 之间。

（三） 文库质量和数据产出要求：

*. 文库质检合格后，每个转录组文库测序数据量大于****；

*. 目标捕获细胞数*****个，浮动范围在**%以内；

*. 细胞平均*****＞***；

*. 细胞基因中位值≥****；

*. 测序饱和度**%~**%；

*. 测序数据基因组比对率≥**。

*. 单细胞**×平台组学技术参数

* 原始数据质控预处理软件：*** ********官方软件**** ******；

* 基因比对软件：**** （******* *********** ********* ** * *********）；

* 基因定量后质控数据标准化处理包：******；

* 服务商需提供数据交付与可视化平台（可基于开源软件或成熟商业平台搭建），支持采购人进行数据浏览、基因查询、图表可视化等操作。

*. 单细胞**×平台分析内容

* 测序数据质量评估：根据上述技术参数将比对到参考基因组的结果用于计算每个样品相关测序数据质量，并提供测序数据质量及各样本细胞质量的相关统计信息；

* 基因定量质控：使用 **** ****** 对样本进行质控，其内部整合了 ****软件，将 ***** 比对到参考基因组后，获得原始数据中高质量细胞数、基因数及基因组比对率等质控结果，从而对每个样品的质量进行评估；

* 基因定量后质控：在 **** ****** 初步质控的基础上进一步对实验数据进行质控，剔除多细胞、双细胞或者未结合上细胞的数据，进行下游分析；

* 去除批次效应：采用*******算法去除批次效应，从而保证样本中的异质性均来自于实验设计或者细胞类型的差异；

* 降维聚类和可视化：基于批次校正后的结果，使用****（统一流形逼近与投影） 进行降维可视化，并采用 ****** 聚类算法对细胞进行分群；

* ****** 基因鉴定与可视化：使用********检验方法对指定细胞群与其余所有细胞群进行差异检验，筛选的条件为：*****.********* 大于 *, *-***** 小于等于 *.**，***.***（基因在所有细胞中的表达占比）大于 *.**，从而得到每个细胞群所有的 ****** 基因；

* 细胞类型鉴定：细胞类型鉴定以自动注释为辅，人工鉴定为主进行。其中自动注释使用软件**********包进行，更为精准的人工鉴定则通过已知******基因的表达特征来完成，这种方法能够充分考虑细胞的特异性表达模式，从而获得更可靠的细胞类型注释结果。两种方法相互补充，最终以人工鉴定的结果为准；

* 差异基因表达分析：使用******包中的****_*****_******函数进行差异表达基因筛选，默认使用 ****** 差异检验方法。进一步根据差异倍数（**********）及显著性检验（******）筛选显著的差异表达基因；

* 差异基因功能分析：利用**/****数据库对差异蛋白编码基因进行功能注释，并用超几何分布检验的方法计算每个 ******* 条目中差异基因富集的显著性；

* 基因集富集分析：常见的有两种，****(**** *** ********** ********，****)基因集富集分析，常用于有预定义的基因集(通常来自功能注释或先前实验的结果)情况下，基于****分析判断此基因集内基因的协同变化对表型变化的影响。****(**** *** ********* ********, ) 基因集变异分析，主要通过将基因在不同样品/不同细胞群间的表达量矩阵转化成基因集在样品/ 细胞群间的表达量矩阵，用于评估不同的通路在不同样品间/不同细胞群间的富集程度。

* 细胞亚群鉴定：根据先前细胞聚类的结果，从中挑选感兴趣的特定细胞群进行亚群细分；

* 拟时序分析：针对重点关注的细胞类型进行拟时序分析，通过*******软件进行轨迹分析，探索细胞分化轨迹，描绘在细胞分化过程中基因表达的变化规律，揭示与疾病发展或者个体发育相关的关键基因；

* 细胞间通讯：使用***********或********软件包进行细胞间配体-受体相互作用分析，以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象，获取细胞中的配体及受体信息，获得细胞间的信号通讯关系，以阐明在广泛的生物学过程中细胞间通讯的复杂性、多样性和动态性。

* 转录因子调控网络：采用******软件结合 **********的****** 数据库和 ********通过默认参数运行，分析转录组调控子及其靶基因的关系，找出的关键*******中的靶基因可与前期挖掘到的差异基因进行联合分析，探索关键**是否参与调控差异基因的变化，另一方面，通过比较不同细胞群或同一细胞群在不同分组中与各调控关系活跃性的强弱差异，确定与目标细胞群特异相关的调控网络。在寻找到关键靶基因后可利用细胞实验或者基因敲除等技术进行验证。

* 其他个性化分析：应用*** ******** 分析，采用 ******** 算法，通过计算细胞内 **** 剪接前后比例来估计每个细胞中每个基因的***速率值，推断细胞的下一个可能的分化方向。应用********分析，根据单细胞转录组数据中的基因表达量，使用 ********包评估染色体上每个区域的***值,将基因根据染色体位置进行排序，并使用 *** 个基因作为滑动窗口大小计算基因表达平均值，然后以正常细胞表达量作为对照，去噪后生成最终 *** 结果文件，从而发现真正的拷贝数变异信号，并预测 *** 区域，推断肿瘤单细胞转录组数据中体细胞染色体大片段变异情况。

*. 交付要求

* 、项目周期：合同签订自采购人提供合格组织样本起，至交付全部数据和分析报告止应在**个工作日内。

* 、交付物清单要求：① 原始测序数据（*****/***）；② **** ******输出文件及表达矩阵；③ 完整分析报告（***/****）；④ 所有图表源文件（******以上）；⑤ 生信分析中间文件（******/******对象等）。

* 、知识产权归属：本项目所有产生的数据、结果、知识产权完全归采购人所有，服务商不得擅自使用或向第三方泄露。

二、**空间转录组测序 具体需求参数

*. ** 空间转录组参数指标

（*）检测技术方法：二代测序

（*）检测平台要求：******-**

*. ** 空间转录组测序技术参数

* 测序策略：双端测序*****；

* 测序量：**** *********/样本；** *********/样本；

* 基因比对/定量软件：*** ***********-*.*.*；

* 定量后质控：采用全局缩放标准化方法( ************ )；

* 降维聚类分析：采用*******聚类算法，*** 进行降维， **** /****进行聚类可视化；

* ****** 基因筛选：使用 ******检验方法进行 ****** 基因鉴定，筛选的条件为：*****.********* 大于 *, ***.***（基因在所有细胞中的表达占比）大于 *.**；

* ****** 基因热图；

* ****** 基因空间可视化图；

* ****** 基因小提琴图；

* 细胞类型鉴定：

*） 有单细胞数据：****分析，*********分析，*************分析，***分析；

*） 无单细胞数据：**********数据库，***********数据库，**************分析；

* 差异分析：默认使用 ******差异检验方法，筛选标准为差异倍数（**********）>*.*及差异显著性检验（******）>*.**；

* 差异比较火山图；

* 差异基因聚类热图；

* ** 功能富集分析（富集圈图、富集气泡图、柱形图绘制、差异富集气泡图）；

* **** 功能富集分析（富集圈图、富集气泡图、柱形图绘制、差异富集气泡图）；

* 蛋白互作网络分析（***分析）；

* **** 分析、****分析；

* ******** 细胞通讯分析、***********细胞通讯分析、*******细胞通讯分析；

* ****** 分析；

* ******* 时序分析；

* ******** 分析；

*. 空间转录组项目经验

具备空间转录组大项目服务经验，单个大项目的样本数量不低于**例，至少*个案例，需提供相应项目的签字盖章合同复印件材料；

* 、公司软实力类参数指标：

*. 设备与平台资质：**×******** ********* 采购合同复印件，近三年 ****** **, ***** *************, *.* ** 试剂盒（不少于**个）购买记录发票复印件。

*. 项目经验：提供近*年内参与并署名的单细胞测序相关的***文章至少*篇。

* 、 售后服务保障：

*. 投标商拥有在*个工作日内对招标人的服务要求作出响应的能力；

*. 成立专业的售后服务项目组，数据分析人员至少*名；

*. 所有的售后修回，除需要大量重写代码的数据分析外，均不得再进行二次收费；

* 、其他要求：

*. 投标商不得联合投标或者中标后外包，本项目使用的所有仪器平台必须是投标商或其下属全资子公司拥有；

三、全基因组外显子测序 具体需求参数

*. 全基因组外显子测序实验方法

(*) 样本的***抽提、********检测浓度及质量，*****准确检测***浓度，琼脂糖电泳检测***完整性；

(*) 使用******* **********人全外显子**文库试剂盒所带打断酶将基因组 *** 剪切成短片段，纯化剪切的脱氧核糖核酸 (***) 。 安捷伦的接头连接到平滑末端，并通过聚合酶链式反应 (***) 扩增文库。扩增的文库与定制探针杂交。与探针结合的 *** 片段用试剂盒中提供的缓冲液洗涤和洗脱；

(*) 对文库进行质检，判断文库峰形、浓度等是否合格；

(*) 质检合格的文库利用二代测序仪（******** ******* ****或*** **）进行*****测序；

(*) 数据下机后对原始数据进行初步质控，初步质控合格的样本继续进行后续分析。

*. 全基因组外显子测序技术参数

(*) 测序数据质量控制；

对原始测序数据进行质量控制获取 ***** *****，预处理软件为 *****，过滤标准如下：

*. 去除接头序列；

*. 去除 * （非 ****）碱基大于等于 * 的 *****；

*. 以 * 个碱基为 ******* 的 **** 进行滑窗，其平均碱基质量值小于 **，则切除；

*. 经过上述过滤后，去除长度小于 ** ** 或平均碱基质量值小于 ** 的 *****。

(*) 参考基因组比对；

利用 *** 将 ***** ***** 比对到参考基因组上，比对结果经过 ******** 转换格式后，利用 ****** 去冗余。

(*) 测序覆盖深度分析；

用 ******** 软件对比对结果进行分析。

(*) *** &***; ***** 鉴定、注释及统计；

使用 ***** 软件的 *************** 模块进行 *** 和 ***** 检测。为了降低 *** 和 ***** 检测的错误率，选用 ** >= *.* 的标准进行过滤，只保留满足该条件的突变位点。

利用 ******* 软件对 *** 和 ***** 检测结果进行注释，人类的 *** &***; ***** 检测结果会额外注释到千人基因、****、*******、******、****、*******、********、**************、******、***********、**** 等数据库。

(*) *** 与 ***** 分布分析；

(*) *** 检测；

使用软件包******从测序数据中推断出拷贝数变异。

(*) ** 检测；

应用*****软件来检测结构变异（**）。

(*) ****** 。

(*) 肿瘤的高级分析（可选）；

将患者正常组织中检测到的变异与 ***数据库以及******数据库比较，筛选可能的癌症易感基因。通过非负矩阵分解（***)的方法，提取出体细胞点突变的突变特征。将体细胞变异与已知驱动基因（******；**** *************；******）进行比较，筛选出肿瘤样本中的已知驱动基因。肿瘤高频突变分析使用*****软件，通过*种方法进行高频突变基因检验，包括卷积检验（**）、****** 检验（****）、似然比检验（***）。使用*****软件的********-********模块进行肿瘤基因组突变相关性分析。使用 **************软件进行驱动基因预测分析。使用*******-*****软件对体细胞***进行分析，然后使用 ******软件来评估 *** 重现性。采用*******-*****软件检测肿瘤样本中处于杂合性缺失的区域，进一步通过**-*****软件获取处于***区域的的突变位点。********软件基于概率模型计算肿瘤样本的纯度和倍性。使用*******软件研究肿瘤的克隆结构。

*. 全基因组外显子测序项目经验

(*) 辅助客户发表***文章，**＞**分，至少*篇，需提供文章信息；

(*) 技术团队具备辅助客户完成医学方向大样本量多组学项目的经验（样本数目＞***个，包含基因组重测序或外显子测序），并以共同一作发表***文章，**＞**分。

*. 公司软实力类参数指标：

（*） 投标商需具备丰富的基因组学、蛋白质组学和代谢组学技术服务经验，且从事相关技术服务时间不低于**年；

（*） 合作过项目金额超过**万的项目不低于**个，需提供相应项目的盖章合同原件材料复印件；

（*） 具备处理多个物种、多种组织的经验，包括动物组织、血液、骨骼、粪便、体液、植物的多种组织、微生物包含细菌、真菌等，处理过的物种、组织多达几百种，针对大量不同的组织都有相关的处理方案***；

（*） 公司分析平台具备至少**项以上已授权软著。

* 、 售后服务保障：

*. 投标商拥有在*个工作日内对招标人的服务要求作出响应的能力，并提供上门服务；

*. 成立专业的售后服务项目组，数据分析人员至少*名；

*. 所有的售后修回，除需要大量重写代码的数据分析外，均不得再进行二次收费；

*. 云平台服务：拥有独立的云平台，需要提供云平台网站首页截图；

*. 多组学联合分析：拥有独立的多组学平台，能同时提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组、表观组、微生物组检测及分析服务，并提供多组学联合分析服务。

* 、其他要求：

*. 投标商不得联合投标或者中标后外包，本项目使用的所有仪器平台必须是投标商或其下属全资子公司拥有；

四、有参转录组测序 具体需求参数

*. 有参转录组参数指标

（*）检测技术方法：二代测序

（*）检测平台要求：******** ******* * ****、******-**

*. 有参转录组测序技术参数

* 测序策略：双端测序*****

* 测序量：*** *** ****/样本；

* 原始*****碱基质控软件：***** (*.**.*)，--******_******** **；

* 原始*****质量评估软件：****** (**.**.*)，*******；

* 基因比对软件：******（*.*.*），--***-********** ** --**；

* 基因定量软件：*****-*****（*.**.*），-* *******；

* 生物学重复、配对差异分析软件：******(*.**.*)，******(******)>*.**, |**************|>*；

* 非生物学重复差异分析软件：*****（*.**.*），******(******)>*.**，|**************|>*；

* 差异比较火山图；差异基因聚类热图；差异基因表达水平雷达图；

* ** 功能富集分析（富集圈图、富集气泡图、柱形图绘制、差异富集气泡图）；

* **** 功能富集分析（富集圈图、富集气泡图、柱形图绘制、差异富集气泡图）；

* 蛋白互作网络分析（***分析，视具体物种而定）；

* **** 分析；

* 转录因子及其靶基因预测分析（视具体物种而定）；

* 拥有自主研发的分析云平台，供用户后续进行自主分析。

* 有参转录组项目经验

* 具备有参转录组大项目服务经验，单个大项目的样本数量不低于****例，需提供相应项目的签字合同原件材料；

*. 公司软实力类参数指标：

（*） 投标商需具备丰富的基因组学、蛋白质组学和代谢组学技术服务经验，且从事相关技术服务时间不低于**年；

（*） 合作过项目金额超过**万的项目不低于**个，需提供相应项目的盖章合同原件材料复印件；

*. 售后服务保障：

（*）投标商拥有在*个工作日内对招标人的服务要求作出响应的能力，并提供上门服务（*） 成立专业的售后服务项目组，数据分析人员至少*名；

（*）所有的售后修回，除需要大量重写代码的数据分析外，均不得再进行二次收费；

*. 其他要求：

（*） 投标商不得联合投标或者中标后外包，本项目使用的所有仪器平台必须是投标商或其下属全资子公司拥有；

（*）投标商 或下属全资子公 司应同时具备转录组、蛋白组、代谢组的实验平台；

（*）多组学联合分析：拥有独立的多组学平台，能同时提供转录组、蛋白组、代谢组检测及分析服务，并提供多组学联合分析服务；

（*）云平台服务：拥有独立的云平台，需要提供云平台网站首页截图。

五、***定量蛋白质组学具体需求参数

*.*** 定量蛋白质组学（******-*****）参数指标

（*）色谱-质谱仪器：色谱仪：******** ***液相系统（************）质谱仪器：****** ******

（*）检测时长：*****

（*）质谱仪器平台数量：公司至少拥有*套******** ******质谱平台

（*）检测方式：***质谱采集模式蛋白质组技术

（*）质量误差：*****

（*）数据库要求：公共库采用********* ******** _****_**** *******_********。同时，需要具备独立自建库，自建库基于重标多肽建立的本地数据库，其库容量不少于*****条多肽，蛋白数量不少于****种蛋白

（*）质控要求：

包含每个**孔板*个标准****质控。

包含真实样品混合后分为等份的**质控（*****），随行处理和上机，每个**孔板*个**质控。

包含真实样本肽段混合后分为等份进行肽段质控（*****），每隔**例样本插入*例。

每个样本中加入**条外源多肽用于质控单个样本的稳定性的***质控。

质控标准：要求**样本的**中位数小于**%，**样本两两相关性不小于*.**，***保留时间**中位数小于**%。****标准****质控样本蛋白鉴定数量不低于****个。

*. 质保及服务承诺：

中标人需为本项目配备足够的售后服务力量； 中标人提供该服务项目的免费保修/维护期至少 * 年； 中标人售后服务提供建立售后服务企业微信群，有专人售后技术支持响应项目售后需求，响应时间*小时以内。

*. 交付内容：

* ）提供质谱数据搜库定性定量结果；

* ）质控统计分析、样本鉴定结果统计、组间鉴定结果统计、蛋白表达丰度图、密度图、分子质量分布图、肽段数分布图、肽段长度分布图等。

* ）差异蛋白筛选分析及***、火山图、热图、相关性分析等；

* ）针对差异表达蛋白获取其**功能信息并绘制**统计分析图；

* ）针对差异表达蛋白获取其参与的*******功能信息并进行*******显著性统计学分析；

* ）根据生物学功能构建蛋白互作图谱；

* ）提供发文所需的鉴定实验程序及数据分析整理方法，同时提供补充材料，具体包括：实验方法与仪器、查库参数、结果说明。

六、***磷酸化蛋白质组具体需求参数

*.*** 磷酸化蛋白质组参数指标

项目内容：

（*）：质谱仪器：****** ******** ******高分辨质谱，具备***质谱采集能力

（*）：检测方式：***质谱采集模式的***磷酸化修饰蛋白质组技术，对磷酸化修饰位点进行全谱定性定量分析

（*）：检测时长：*****

（*）：流动相及分离：*液为*.*%甲酸水溶液，*液为*.*%甲酸/**%乙腈/**%水溶液，多步梯度洗脱

（*）：质谱采集参数：********分辨率******，***扫描范围***-*** */*，*** ****** ***%；**/**扫描范围***-**** */*，隔离窗口* */*，***碰撞能**%，***** **** *.**

（*）：磷酸化富集：采用磷酸化肽段富集

（*）：内标质控：每个样品按***标准肽段:待测样品=*:**加入***内标（**条外源合成肽段，*********），用于色谱系统校正及定量质控

（*）：数据解析：***原始数据采用***********软件（*********** ******，*********）搜库定性定量；数据库采用*******对应物种********数据库

（*）：搜库参数：酶*******/*，最大漏切位点*；固定修饰***************(*)；可变修饰*********(*)、******(******* *-****)、*******(***)；*********/******* ****** ******均≤*.**，定量层级***

（**）：质控要求：随行**质控、***内标质控、保留时间质控、质量精度质控等

（**）：学术影响力：投标公司现任员工有人体疾病相关修饰蛋白质组学研究分析且文章发表经验（****年*月*日及之后发表的文章，需为第一作者或共同一作或通讯作者或共同通讯），影响因子≥**分为准。所提供符合要求的文章≥*篇或总影响因子≥**分。

*. 质保及服务承诺：

中标人需为本项目配备足够的售后服务力量； 中标人提供该服务项目的免费保修/维护期至少 * 年； 中标人售后服务提供建立售后服务企业微信群，有专人售后技术支持响应项目售后需求，响应时间*小时以内。

*. 交付内容：

* ）提供质谱数据搜库定性定量结果（磷酸化修饰位点、肽段、蛋白三个层级定量表）；

* ）质控统计分析、鉴定位点结果统计、组间鉴定结果统计、位点表达丰度图、肽段长度分布图、蛋白对应修饰位点数分布图、肽段对应修饰位点数分布图、磷酸化位点百分比图等；

* ）差异磷酸化位点筛选分析及***、火山图、热图、相关性分析等；

* ）针对差异磷酸化位点对应蛋白获取其**功能信息并绘制**富集统计分析图；

* ）针对差异磷酸化位点对应蛋白获取其参与的*******功能信息并进行*******显著性统计学分析（****、********、********富集分析）；

* ）根据生物学功能构建蛋白互作网络图谱（***分析），并开展亚细胞定位分析、******功能分类分析；

* ）提供发文所需的鉴定实验程序及数据分析整理方法，同时提供补充材料，具体包括：实验方法与仪器、查库参数、结果说明；

* ）提供发表文章所必须的数据。

七、**-**/**全谱代谢组（****）具体需求参数

*.**-**/** 全谱代谢组（双柱-****）参数指标

项目内容：

* 、采用***的扫描模式对样本进行代谢组检测；

* 、采用双柱模式进行检测，其中反相体系检测单个样本的分离时长不少于*****，亲水体系检测单个样本的分离时长不少于****，反相体系和亲水体系采用正负离子分开采集的模式，单个样本的总检测时长不少于*****；

* 、代谢物的鉴定参考国际定性标准，其中******与标准品库物质进行匹配，******和******的检测物质数量不少于***个；

* 、**样本（实测样本提取后混样）中所有内标（不少于**个同位素内标）的信号值***（相对标准偏差）的中位数不超过**%；；

* 、**样本（实测样本提取后混样）中，**%两两比较**的**≥*.**（**基于未做缺失值填充的数据进行计算）。

* 、分析内容包括但不限于：质控数据分析、差异代谢物分析（（差异代谢物定性定量表、火山图、聚类热图、箱型图、**********图、相关性图、****富集分析、********富集分析、****分析））

*. 质保及服务承诺：

中标人需为本项目配备足够的售后服务力量； 中标人提供该服务项目的免费保修/维护期至少 * 年； 中标人售后服务提供建立售后服务企业微信群，有专人售后技术支持响应项目售后需求，响应时间*小时以内。

*. 交付内容：

*) 代谢分析提供质谱数据搜库定性定量结果

*) 质控统计分析、样本鉴定结果统计、组间鉴定结果统计等；

*) 差异代谢物筛选分析及***、火山图、热图、相关性分析等；

*) 针对差异表达代谢物获取其参与的*******功能信息并进行*******显著性统计学分析；

*) 二级镜像图：提供项目鉴定所有***** ***等级的代谢物的二级镜像图。

*) 提供发文所需的鉴定实验程序及数据分析整理方法，同时提供补充材料，具体包括：实验方法与仪器、查库参数、结果说明；

*) 发表文章所必须的数据。

技术参数联系人：刘老师 ***********

参与本项目论证报名联系：赵老师 ***-********

报名：有意向单位，于****年**月**日**:**之前，将单位名称、联系人姓名、电话、参与的论证项目名称等报名信息， 发至此邮箱*********@**.***

采购需求调查表-基因检测项目.****

备注：现场论证的具体时间和地点，后续*-*周内会邮件通知，请及时关注邮件信息！